کریسپر چیست؟

بیوتکنولوژی به دوره جدیدی از روش‌های جهش‌زایی وارد شده است که می‌تواند جایگزین روش‌های جهش‌زایی مرسوم شود. سیستم CRISPR/Cas9 برای اولین بار در گونه‌های باکتریایی یافت شد و از سال 2013 به عنوان یک ابزار قدرتمند ویرایش ژنوم مورد استفاده قرار گرفت. در این مقاله کریسپر به طور کامل توضیح داده شده است.

کریسپر (CRISPR) یک ابزار قدرتمند برای ویرایش ژنوم است، به این معنی که به محققان اجازه می دهد تا به راحتی توالی DNA را تغییر دهند و عملکرد ژن را اصلاح کنند وکاربردهای بالقوه زیادی دارد، از جمله اصلاح نقایص ژنتیکی، درمان و پیشگیری از گسترش بیماری ها و بهبود رشد و انعطاف پذیری محصولات.  کریسپر مخفف "CRISPR-Cas9" است. کریسپر ها بخش های تخصصی DNA هستند و پروتئین Cas9 - جایی که Cas مخفف "CRISPR-associated" است - آنزیمی است که مانند یک جفت قیچی مولکولی عمل می کند و قادر به برش رشته های DNA است. فناوری کریسپر از مکانیسم‌های دفاعی طبیعی باکتری‌ ها و آرکئی ها، اقتباس شده است. این موجودات از RNA مشتق شده از کریسپر و پروتئین های مختلف Cas برای خنثی کردن حملات ویروس ها استفاده می کنند. پس از حمله ویروس، باکتری میزبان DNA ویروس‌ها را خرد می‌کنند و سپس تکه‌هایی از آن DNA را در ژنوم خود ذخیره می‌کنند تا در صورت حمله مجدد آن ویروس‌ها، به عنوان سلاحی در برابر مهاجمان خارجی استفاده شود. هنگامی که اجزای کریسپر به موجودات پیچیده‌تر دیگر منتقل می‌شوند، آن اجزا می‌توانند ژن‌ها را دستکاری کنند، فرآیندی که «ویرایش ژن» نامیده می‌شود.
 

اجزای اصلی کیرسپر

 
اصطلاح CRISPR مخفف «خوشه‌هایی از تکرارهای کوتاه پالیندرومیک با فاصله منظم» است و ناحیه‌ای از DNA را توصیف می‌کند که از توالی‌های کوتاه و تکراری تشکیل شده است که از دو طرف یکسان خوانده می شود. وقتی در مورد تکرار در کد ژنتیکی صحبت می کنیم، در مورد ترتیب پله ها در نردبان مارپیچی یک مولکول DNA صحبت می کنیم. هر پله شامل دو پایه شیمیایی است که به هم متصل شده اند: یک پایه به نام آدنین (A) به دیگری به نام تیمین (T) و پایه گوانین (G) با سیتوزین (C) جفت می شود. به گفته مؤسسه ماکس پلانک، در یک منطقه کریسپر، این پایگاه‌ها چندین بار به یک ترتیب ظاهر می‌شوند و در این بخش‌های تکراری، توالی‌های «پالیندرومیک» را تشکیل می‌دهند. در یک توالی پالیندرومیک، هنگامی که آنها را در جهت مخالف می خوانید، پایه های یک طرف نردبان DNA با پایه های طرف مقابل مطابقت دارند. به عنوان مثال، یک دنباله پالیندرومیک فوق العاده ساده ممکن است شبیه به این باشد:
 سمت 1 - GATC
 سمت 2 - CTAG
تکرارهای کوتاه پالیندرومیک در سرتاسر نواحی  DNA کریسپر ظاهر می‌شوند و هر تکرار توسط «فاصله اندازها» بسته می‌شود. باکتری‌ها چنین فاصله ‌اندازهایی را از ویروس‌هایی که به آنها حمله کرده‌اند در خود ذخیره کرده اند، به این معنی که کمی از DNA ویروسی را در ژنوم خود وارد می‌کنند. این فاصله‌دهنده‌ها به‌عنوان بانکی از حافظه‌ها عمل می‌کنند که باکتری‌ها را قادر می‌سازد تا ویروس‌ها را در صورت حمله مجدد، شناسایی کنند. CRISPR RNA (crRNA)، نواحی DNA کریسپر به عنوان نوعی بانک از خاطرات ویروسی عمل می کنند. برخلاف توالی‌های DNA که در داخل مولکول DNA قرار می‌گیرند، این CRISPR RNA (crRNA) می‌تواند در سلول پرسه بزند و با پروتئین‌ها متحد شود - یعنی قیچی‌های مولکولی که ویروس‌ها را به قطعات خرد می‌کند.RNA همچنین از این جهت با DNA متفاوت است که تنها یک رشته است، نه دو رشته، به این معنی که فقط نیمی از یک نردبان به نظر می رسد. برای ساختن یک مولکول RNA، بخشی از کریسپر به عنوان یک الگو عمل می کند و پروتئین هایی به نام پلیمرازها وارد می شوند تا یک مولکول RNA را بسازند که "مکمل" آن الگو است، به این معنی که پایه های دو رشته مانند قطعات پازل در کنار هم قرار می گیرند. برای مثال، یک G در مولکول DNA به صورت C در RNA رونویسی می شود. crRNA با پروتئین Cas9 و نوع دیگری از RNA به نام tracrRNA تعامل دارد تا به باکتری ها در دفع ویروس ها کمک کند. Cas9 آنزیمی است که DNA خارجی را برش می دهد. این پروتئین به crRNA و tracrRNA متصل می شود، که با هم Cas9 را به محل هدفی در رشته DNA ویروس هدایت می کنند، جایی که پروتئین برش خود را انجام می دهد.  Cas9 در هر نقطه از ژنوم برش ایجاد نمی کند بلکه توالی‌های DNA کوتاه که به عنوان PAM که در مجاورت توالی DNA هدف قرار می‌گیرند را شناسایی می کند. اگر مجموعه Cas9 یک PAM را در کنار توالی DNA هدف خود نبیند، برشی انجام نمی شود. طبق بررسی سال 2014 که در Nature Biotechnology منتشر شد، این یکی از دلایل احتمالی است که Cas9 هرگز به ناحیه کریسپر در باکتری ها حمله نمی کند.
 

 
مطالعات به این نتیجه رسیدند که برای هدایت Cas9 به جدا کردن یک ناحیه خاص از DNA، دانشمندان به سادگی می توانند توالی crRNA را تغییر دهند، که به دنباله ای مکمل در DNA هدف متصل شود. این سیستم با ترکیب crRNA و tracrRNA برای ایجاد یک "RNA راهنمای یا sgRNA" است. بنابراین، ویرایش ژنوم تنها به دو جزء نیاز دارد: RNA راهنما و پروتئین Cas9.

چه کسی کریسپر را شناسایی کرد؟

 
به گزارش مجله کوانتا، دانشمندان ابتدا کریسپر ها را در باکتری ها در سال 1987 کشف کردند، اما در ابتدا اهمیت بیولوژیکی توالی های DNA را درک نکردند و هنوز آنها را "CRISPRs" نمی نامیدند. یوشیزومی ایشینو و همکارانش در دانشگاه اوزاکا در ژاپن برای اولین بار تکرارهای نوکلئوتیدی و فاصله‌ اندازهای مشخصه را در میکروب روده اشریشیا کلی یافتند و با بهبود فناوری تجزیه و تحلیل ژنتیکی در دهه 1990، محققان دیگر کریسپر ها را در بسیاری از میکروب‌های دیگر یافتند. بر اساس گزارشی که در سال 2016 در مجله Cell منتشر شد، فرانسیسکو موجیکا، دانشمند دانشگاه آلیکانته در اسپانیا، اولین کسی بود که ویژگی‌های متمایز کریسپر را توصیف کرد و توالی‌ها را در 20 میکروب مختلف یافت. به گزارش کوانتا، در سال‌های بعد، دانشمندان همچنین ژن‌های Cas و عملکرد آنزیم‌های Cas را کشف کردند و متوجه شدند که فاصله‌ اندازها در کریسپر ها از ویروس‌های مهاجم می‌آیند. از جمله این محققان پیشگام، جنیفر دودنا، استاد بیوشیمی، بیوفیزیک و زیست شناسی ساختاری در دانشگاه کالیفرنیا، برکلی بود که در ادامه جایزه نوبل 2020 در شیمی را با امانوئل شارپنتیر، مدیر واحد ماکس پلانک برای علم به اشتراک گذاشت.
 

نحوه استفاده از کریسپر به چه صورت است؟

 
در سال 2013، محققان در آزمایشگاه‌های چرچ و ژانگ اولین گزارش‌هایی را منتشر کردند که در آن استفاده از CRISPR-Cas9 برای ویرایش سلول‌های انسانی در یک محیط آزمایشی توصیف شد. مطالعات انجام شده در آزمایشگاه و مدل های حیوانی بیماری های انسانی نشان داده است که این فناوری می تواند به طور موثر نقایص ژنتیکی را اصلاح کند. بر اساس یک مقاله مروری که در سال 2016 در مجله Nature Biotechnology منتشر شد، نمونه هایی از چنین بیماری هایی شامل فیبروز کیستیک، آب مروارید و کم خونی است. این مطالعات راه را برای کاربردهای درمانی در انسان هموار کرده است. در حوزه پزشکی، CRISPR در مراحل اولیه آزمایشات بالینی به عنوان درمان سرطان و به عنوان درمانی برای یک اختلال ارثی که باعث نابینایی می شود آزمایش شده است. لایو ساینس قبلا گزارش داده است که این روش همچنین به عنوان یک استراتژی برای جلوگیری از انتشار بیماری لایم و مالاریا از ناقلان ویروسی به افراد مورد بررسی قرار گرفته است و همچنین در مدل های حیوانی HIV به عنوان راهی برای خلاص شدن از سلول های آلوده از ویروس مورد مطالعه قرار گرفته است. یک تیم تحقیقاتی در چین تلاش کرد تا HIV یک بیمار انسانی را با استفاده از CRISPR درمان کند، و در حالی که این درمان در درمان عفونت موفقیت‌آمیز نبود، ژن‌درمانی نیز اثرات مضری در پی نداشت. نویل سانجانا از مرکز ژنوم نیویورک و استادیار زیست شناسی، علوم اعصاب و فیزیولوژی در دانشگاه نیویورک گفت: "من فکر می کنم درک عمومی از CRISPR بسیار بر ایده استفاده از ویرایش ژن به صورت بالینی برای درمان بیماری متمرکز است." این بدون شک یک امکان هیجان‌انگیز است، اما این تنها یک قطعه کوچک است. فناوری کریسپر همچنین در صنایع غذایی و کشاورزی به کار رفته است. همچنین در محصولات زراعی برای بهبود عملکرد، تحمل به خشکی و خواص تغذیه ای استفاده می شود. در آوریل 2017، تیمی از محققان تحقیقی را در مجله Science منتشر کردند مبنی بر اینکه آنها یک مولکول CRISPR را برای یافتن گونه‌هایی از ویروس‌ها مانند زیکا در سرم خون، ادرار و بزاق برنامه‌ریزی کردند. در 2 آگوست 2017، دانشمندان در مجله Nature فاش کردند که با استفاده از CRISPR نقص بیماری قلبی را در یک جنین با موفقیت برطرف کردند. در 2 ژانویه 2018، محققان اعلام کردند که ممکن است بتوانند قارچ ها و سایر مشکلاتی را که تولید شکلات را تهدید می کند با استفاده از CRISPR متوقف کنند تا گیاهان را در برابر بیماری مقاوم تر کنند. بر اساس تحقیقات منتشر شده توسط مجله BioNews، در 16 آوریل 2018، محققان CRISPR را برای ویرایش هزاران ژن به طور همزمان ارتقا دادند. با این حال، با وجود طیف گسترده ای از کاربردها، این ابزار بدون اشکال نیست. چرچ به Live Science گفت: "من فکر می کنم بزرگترین محدودیت CRISPR این است که صد در صد کارآمد نیست." این بدان معناست که در یک آزمایش مشخص، CRISPR ممکن است تنها درصدی از DNA هدف را با موفقیت ویرایش کند. بر اساس مقاله 2014 Science توسط Doudna و Charpentier، در مطالعه ای که بر روی برنج انجام شد، ویرایش ژن در نزدیک به 50٪ از سلول هایی که Cas9-RNA را دریافت کردند، رخ داد. در همین حال، تحلیل‌های دیگر نشان داده‌اند که بسته به هدف، بازده ویرایش می‌تواند به ۸۰ درصد یا بیشتر برسد. این فناوری همچنین می تواند "جهش زایی غیر هدف" را زمانی که DNA در مکان هایی غیر از هدف مورد نظر بریده می شود، ایجاد کند. این می تواند منجر به ایجاد جهش های ناخواسته شود. علاوه بر این، چرچ خاطرنشان کرد، حتی زمانی که سیستم بر روی هدف قطع می‌شود، احتمال عدم دریافت ویرایش دقیق وجود دارد. او این مکانیسم را "وندالیسم ژنوم" نامید.
 

خطرات بالقوه و نگرانی های اخلاقی استفاده از کریسپر

بسیاری از کاربردهای بالقوه فناوری کریسپر سوالاتی را در مورد مزایای اخلاقی و پیامدهای دستکاری در ژنوم ایجاد می کند و به طور خاص، بحث های اخلاقی زیادی در سال 2018 شعله ور شد بعد از اینکه هی جیانکوی، بیوفیزیکدان در دانشگاه علوم و فناوری جنوبی در شنژن، اعلام کرد که تیم او DNA را در جنین انسان ویرایش کرده است و بنابراین اولین ویرایش ژنی جهان را در نوزادان ایجاد کرده است. قبلا گزارش دشه است که او متعاقباً به دلیل طبابت بدون مجوز، نقض مقررات چین در مورد فناوری باروری به کمک انسان و ساخت اسناد بازبینی اخلاقی به سه سال زندان و 3 میلیون یوان (560000 دلار) جریمه محکوم شده است. اما حتی پس از محکومیت او، آزمایش‌های او سؤالاتی را در مورد چگونگی تنظیم استفاده از کریسپر در آینده ایجاد کرد، به‌ویژه با توجه به اینکه این فناوری هنوز نسبتاً جدید است. البته آزمایش‌های غیرقانونی روی جنین‌های انسانی نشان‌دهنده استفاده نادرست از کریسپر است، اما دانشمندان می‌گویند حتی استفاده‌های به ظاهر اخلاقی از این فناوری می‌تواند خطراتی را به همراه داشته باشد. به طور کلی، ایجاد تغییرات ژنتیکی روی جنین انسان و سلول های تولید مثلی مانند اسپرم و تخمک به عنوان ویرایش ژنومی شناخته می شود. از آنجایی که تغییرات در این سلول‌ها می‌تواند به نسل‌های بعدی منتقل شود، استفاده از فناوری کریسپر برای ایجاد ویرایش‌های ژنومی، نگرانی‌های اخلاقی زیادی را ایجاد کرده است.
 
کارایی متغیر، جهش های ناخواسته و ویرایش های غیر دقیق همگی خطرات ایمنی را به همراه دارند. علاوه بر این، چیزهای زیادی وجود دارد که هنوز برای جامعه علمی ناشناخته است. در مقاله‌ای که در سال ۲۰۱۵ در Science منتشر شد، دیوید بالتیمور و گروهی از دانشمندان، متخصصان اخلاق و کارشناسان حقوقی خاطرنشان کردند که ویرایش ژنومی احتمال عواقب ناخواسته‌ای را برای نسل‌های آینده افزایش می‌دهد، زیرا در دانش ما در مورد ژنتیک انسان، تعاملات ژن و محیط زیست و مسیرهای بیماری (از جمله تداخل بین یک بیماری و سایر شرایط) محدودیت‌هایی وجود دارد. Oye و همکارانش در مقاله Science در سال 2014 به تأثیرات اکولوژیکی بالقوه استفاده از محرک های ژن اشاره کردند. یک صفت معرفی شده می تواند فراتر از جمعیت هدف به موجودات دیگر از طریق تلاقی گسترش یابد. محرک های ژنی همچنین می تواند تنوع ژنتیکی جمعیت هدف را کاهش دهد و به طور بالقوه توانایی آن را برای بقا مختل کند. سایر نگرانی های اخلاقی  عبارتند از آیا باید تغییراتی ایجاد کنیم که بتواند اساساً بر نسل‌های آینده تأثیر بگذارد، بدون اینکه رضایت آنها را داشته باشیم؟ اگر استفاده از ویرایش ژنومی از یک ابزار درمانی به ابزاری برای بهبود ویژگی‌های مختلف انسانی تبدیل شود، چه؟ برای رسیدگی به این نگرانی ها، آکادمی ملی علوم، مهندسی و پزشکی یک گزارش جامع با دستورالعمل ها و توصیه هایی برای ویرایش ژنوم تهیه کردند. اگرچه آکادمی‌های ملی احتیاط را در پیگیری ویرایش ژنومی توصیه می‌کنند، اما تاکید می‌کنند "احتیاط به معنای ممنوعیت نیست". آنها توصیه می کنند که ویرایش ژنومی فقط بر ژن هایی که منجر به بیماری های جدی می شوند و تنها زمانی انجام شود که هیچ جایگزین درمانی معقول دیگری وجود نداشته باشد. آنها همچنین توصیه می کنند که پس از پایان کارآزمایی، سازمان دهندگان کارآزمایی باید خانواده شرکت کنندگان را برای چندین نسل پیگیری کنند تا ببینند چه تغییراتی در ژنوم در طول زمان باقی می ماند.
 
منبع: https://www.livescience.com/58790-crispr-explained.html#section-how-has-crispr-been-used